正就讀中學的少年邁爾斯(沙梅克·摩爾 Shameik Moore 配音)意外被一隻遭受放射性汙染的蜘蛛咬傷,隨後身體發生奇特的變化。偶然機緣,他目睹了蜘蛛俠(克里斯·派恩 Chris Pine 配音)和犯罪頭目金並(列維·施瑞博爾 Liev Schreiber 配音)的戰鬥。爲了阻止金並利用時空對撞機擾亂宇宙,蜘蛛俠最終壯烈犧牲。可未過多久,來自平行宇宙的頹廢的彼德·帕克(傑克·詹森 Jake M. Johnson 配音)出現在邁爾斯面前。爲了阻止金並的陰謀,並幫助這個帕克返回自己的宇宙,他們闖入金並的老巢。在這一過程中,二人遭到章魚博士和徘徊者的狙擊。與此同時,來自其他宇宙的女蜘蛛俠、暗影蜘蛛俠、蜘豬俠、二次元蜘蛛妹相繼出現。
他們合力與惡勢力展開鬥爭……