漸漸習慣了現代生活的美國隊長史蒂夫·羅傑斯（克里斯·埃文斯 Chris Evans 飾），在一次行動後隱隱嗅到神盾局內部所瀰漫出來的兇險氣味。而當得知神盾局正祕密進行的「洞察計劃」後，他更爲此感到憤怒。某天，神盾局指揮官尼克-法瑞（塞繆爾·傑克遜 Samuel L. Jackson 飾）遭到一羣武裝分子襲擊，他拼盡全力將一支U盤交到美國隊長手中，這裡面藏著該局二戰以來最重要且最可怕的祕密。在此之後，美國隊長因涉嫌殺害尼克而遭到前局長亞歷山大·皮爾斯（羅伯特·雷德福/Robert Redford 飾）的通緝和追殺，逃亡中他得到黑寡婦（斯嘉麗·詹森 Scarlett Johansson 飾）和退伍老兵「獵鷹」（安東尼·麥凱 Anthony Mackie 飾）的幫助。
他們必須爭分奪秒解開神盾局的祕密，阻止「洞察計劃」的施行……